GFP

绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。由于具有自发荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。

发光机理

绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，简称GFP）是在美国西北海岸所盛产的一种名为Aequorea victoria的水母中发现的一种可以发出绿色荧光的蛋白质。当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”，导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”，形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程，系由几位科学家分别研究完成的。

绿色荧光蛋白不仅无毒，而且不需要借助其他辅酶，自身就能发光，可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”，科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。在一个活体中有数万种不同的蛋白质，这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。

如果蛋白机制发生故障，通常就会t发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制，这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下，科学家还能对各种细胞的命运了如指掌，比如，脑神经细胞是如何发育起来的，或者癌症细胞是如何扩散的……

今天，已经有了许多新的不同的绿色荧光蛋白变体，这就进一步完善了绿色荧光蛋白作为基因标志在生物研究中的广泛应用。

发现发展

国外情况

Aequorea victoria水母是一种生物发光体。1960年，下村修为搞清它的生物发光机制,参加了普林斯顿大学弗兰克·约翰逊实验室的工作。Aequorea victoria生物发光的活性组分曾被认为是一种与钙离子相关联的蛋白质，被称为水母素（水母素现在仍是一种检测生物体内钙离子的方法之一）。但在此形式下，所发射的是蓝光。对此，下村修曾做了大量的工作来说明所发射的荧光究竟是绿光还是蓝光。研究人员分离了大量的蛋白质，都显示出强烈的绿光，于是他在1962年写道：“由蛋白质所得的溶液在日光下是稍稍发绿的，但在钨灯下则为黄色，在紫外光下则呈现出很亮的、绿色的荧光”。

应当说，对这一问题的认识是在不断提高的。他们在无直接试验证据的情况下，提出了绿色荧光蛋白所发的绿光是因受钙激发而发光的水母素，其能量向绿色荧光蛋白发生了转移所致。按现代的科学术语来说，水母素是作为一种能量给体，而绿色荧光蛋白则成为能量受体。这一观点，后来得到了实验的证实。但应当指出的是两种色素是独立存在的，并无依赖关系。

虽然绿色荧光蛋白最初只是水母素研究中的一项偶然发现的“副产品”，但总的说来，下村修在发现绿色荧光蛋白的过程中作出了重要的贡献。如对其纯化和物理化学表征等方面，以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等，绿色荧光蛋白与水母素两者间的能量转移，并解释了由绿色荧光蛋白发射的是绿光而不是蓝光。如果没有这些经典性开创工作，有关绿色荧光蛋白的出现和广泛应用将推迟几十年，甚至至今它仍作为一种秘密保留在太平洋中。

马丁·查尔菲所从事的研究是有关小线虫神经细胞的发展。当查尔菲第一次听说到绿色荧光蛋白时，他十分激动地从利用分子遗传学方法来研究线虫问题，转移到将绿色荧光蛋白与有机体中蛋白质基因相融合的工作，并先后在两种小线虫中得到表达，即绿色荧光蛋白在不同的有机体中显示出亮绿色的荧光，因此确认了绿色荧光蛋白可作为一种通用的基因标志，而应用于各种有机体中。接着，他还得到了绿色荧光蛋白在有机体内的不同部位和不同时间发展下的表达结果。1994年2月初查尔菲及其合作者把这些研究结果发表在《科学》杂志上，并引起轰动。1985年，道格拉斯·普瑞舍克隆了水母素的基因。

1992年，他又克隆出完整的由238个氨基酸编码的绿色荧光蛋白基因。可惜的是,普瑞舍没有进一步尝试把该基因引入其他生物体内，虽然他在1992年的有关克隆工作的总结中最后指出：“迄今尚无可用的发色团生物合成的有关信息，而这种蛋白质的重组方式可以成为一种有价值的试剂，使我们可在这类特殊的蛋白质内，来试验发色团生成的生物化学，以及在水母素和绿色荧光蛋白间的能量转移机制等”。将绿色荧光蛋白表达到其他有选择的有机体这项工作，具有重大的生物学意义。这就涉及马丁·查尔菲的工作了。

绿色荧光蛋白的荧光形式不仅可用以表达小线虫、果蝇等，对哺乳动物的细胞也适用，从而使定量研究活细胞的动态过程成为可能。查尔菲等人的工作向人们展示出，绿色荧光蛋白作为一种通用的基因标志，在生物研究中有着无限的潜力。

钱永健的贡献

钱永健及其合作者，还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题，从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。这些新变体有的荧光更强，有的呈黄色，有的呈蓝色，有的呈红色，有的可激活、可变色。这意味着除绿色以外，还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。

今天，绿色荧光蛋白及其变体作为基因标志，已实现了工具化，有了通用的“工具盒”，可应用于所有生命体系中的科学研究。钱永健和他的同事不仅加深了对绿色荧光蛋白发光机制的了解，比如分子氧的作用，由此可以解释为什么绿色荧光蛋白在有机体内可容易地发射荧光。更重要的是发现了一些新的具有不同光谱行为的绿色荧光蛋白变体，从紫外部分一直位移到蓝色。这些结果表明，绿色荧光蛋白在进行取代或进行化学转换上是十分活泼的，而这些改进了的绿色荧光蛋白，为其在生物科学中的成功应用铺设了一条康庄大道。

在此笔者还想谈一点感想。虽然这一获奖项目为化学奖，但是它所涉及的大量工作都和生物和生命科学相关，包括所研究对象，以及它的实际应用等。这说明现代科学的分类已不拘泥于以往的格局。这还使我联想到目前我们化学家对于物理和生物科学的生疏，以及物理学家见到苯环结构而害怕的情况。这些现状表明,我们的大学教育确是有进一步改革的必要。

发光特性

GFP吸收的光谱，最大峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder).

GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.

尽管450～490nm（蓝光）是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强，因此更适合于活体检测.

发现

GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。

应用研究

分子标记

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应

用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

药物筛选

许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：

即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

融合抗体

在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。

利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR）的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。

当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。

单链抗体（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

传感器

由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。

但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla）融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白（BLIP）与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。

光伏发电

瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的绿色荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。

GFP结构特点

在蛋白质编号lema中可以看到GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（如右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。

诺贝尔化学奖

2008年10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得诺贝尔化学奖！

成帧规程

GFP，即通用成帧规程 （Generic Framing Procedure）。通用成帧规程属于ITU-T G.7041规范，是一种新的封装规程。在MSTP中，除可以使用传统的点到点协议/高速数据链路协议（PPP/HDLC）、SDH上的链路接入规程（LAPS）作为数据分组的封装协议外，GFP 是一种新的选择方案。GFP 具有成帧映射和透明映射两种方式可以分别应对不同需求的业务。成帧映射需要将客户数据缓存下来再封装到 GFP 帧结构中，此方式适用于对时延、抖动不敏感的业务；对于那些需要更小时延以及更高传输效率的业务，可以采用透明映射方式，即直接将数据从客户数据块中取出，再映射进周期性的、长度固定的 GFP 帧结构中。