聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR)扩增样品中的DNA量和富集众多DNA分子中的一个特定的DNA序列的一种技术。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。

概述

聚合酶链式反应（PCR)扩增样品中的DNA量和富集众多DNA分子中的一个特定的DNA序列的一种技术。在该反应中，使用与目的DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，进行多轮的DNA合成。其中包括DNA变性，引物退火和在TapDNA聚合酶催化下的DNA合成。

作用

聚合酶链式反应是体外酶促合成、扩增DNA片段的一种方法，该方法可以使目标DNA在几个小时内扩增千百万倍，由于它的扩增能力强大，并且可与其他分子生物学方法相结合广泛应用于生命科学各个领域，已经成为近十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一，其发明者KaryMullis和Saiki分别获得了1994和1992年诺贝尔奖。PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；

(2)由少量mRNA生成cDNA文库；

(3)从cDNA中克隆某些基因；

(4)生成大量DNA以进行序列测定；

(5)突变的分析；

(6)染色体步移；

(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

历史

DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

实验操作

1、电泳后剩余的PCR产物加ddH2O至100μl

2、加如10μl3M乙酸钠（pH5.2）和250μl无水乙醇，颠倒混匀

3、12,000rpm高速离心15分钟，观察沉淀，弃去上清液

4、加入1ml75％乙醇，颠倒混匀，洗涤沉淀。

5、12,000rpm高速离心2分钟，彻底弃去上清液

6、室温或37℃，晾干

7、加10μlTE（pH8.0）溶液溶解

合成原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

反应过程

1、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2、退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴乙锭）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

反应特点

特异强

PCR反应的特异决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶反应的忠实；

④靶基因的特异与保守。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶反应的忠实及TaqDNA聚合酶耐高温，使反应中模板与引物的结合(复)可以在较高的温度下进行，结合的特异大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异和保守高的靶基因区，其特异程度就更高。

灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射污染、易推广。

对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

引物设计

1、长度15~30个核苷酸，最多到50个核苷酸左右。（50？为什么？反正太长也没有必要）

2、尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象。（其实有时很难避免，不是很重要）。

3、引物内部不应该形成二级结构，如果引物中有酶切位点时，就会出现引物二聚体。（一般不是很重要）

PCR的反应条件

1、Dntp浓度过高会加快反映速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。

２、引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。

３、TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。

TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1％-0.25％总错误率。

４、在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。

５、DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度Ｔｍ＝4（Ｇ＋ｃ）＋（Ａ＋Ｔ），一般在45～55度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间30秒。

６、延伸温度一般在70～75度这是TaqDNA聚合酶活性最高（150个／Ｓ），当引物在16个碱基以下时可采用缓慢升高温度到70～75度的方法，使在低温下就开始合成。

７、循环次数25～30次。

无产物时

１、取10ul扩增混合液作模板在进行扩增

２、增加TaqDNA聚合酶浓度

３、增加循环次数

４、降低退火温度

５、加靶DNA量

应用

1、根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计特异引物，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术进行PSTVd检测研究。为避免由于提取的RNA降解或者RT-PCR反应质量不高所造成的假阴性问题，在检测过程中引入马铃薯线粒体NADH脱氢酶ND2亚基基因mRNA为内对照，该内对照的一个引物跨越了该基因内含子区域，只对剪接后的mRNA进行特异扩增而不扩增其本身DNA。利用内对照引物和PSTVd特异引物进行双重RT-PCR检测，分别扩增出190bp的内对照基因特异片段和360bp的PSTVd特异条带，与预期引物设计大小一致。引入的内对照可以较好地监控PSTVd的RT-PCR检测过程。

2、用聚合酶链式反应-温度梯度凝胶电(PCR-TGGE)和DNA测序技术分析16例SAD患者及16名正常人CHRNA7基因全部10个外显子及其两侧的部分内含子序列和内含子4的部分基因序列。结果在CHRNA7基因上发现2个新的多态性位点;内含子3区的133418G/C突变，两组相比差异无显著性(χ2=4.571，P＞0.05)；内含子7上的117643+GTG三碱基插入突变，两组相比差异无显著性。

3、利用聚合酶链式反应技术对86例冠心病及100例正常对照者的白细胞介素-1受体拮抗剂基因进行扩增。结果冠心病患者IL-1ra基因频率：IL1RN1／10．8256，IL1RNI／20．1628，IL1RN1／30．0116，IL-1ra等位基因频率：IL1RN*10．9127，IL1RN*20．0814，IL1RN*30．0059，与对照组无差异(P>0．05)。

4、根据不同物种间同一基因核苷酸序列的保守性及相似性的特点，在人和鼠的Pit-1基因第三外显子上设计上游引物，而将下游引物设计在猪Pit-1基因第四外显子上.利用聚合酶链式反应(PCR)技术，扩增出猪Pit-1基因第三内含子序列，并经由酶切及序列同源性比对确认该序列即为猪Pit-1基因第三内含子序列。此序列的确定为下一步进行遗传变异分析的研究奠定了基础。

仪器

PCR(聚合酶链式反应)是指体外酶促合成特异DNA片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。自perkpcr仪in –elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

 为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。

国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。

国内dna扩增仪

1109型，90a/b型，ptc-51a/b型

1109型

北京新技术所与军科院联合

机械臂

变温水浴

电子调温

40×0.5ml

16400元/台

90a/b型

中科院遗传所

机械臂

变温水浴

电热

14000元/台

ptc-51a/b型

军事医学科学院

变温气流

电子调兼作套式

30×0.5ml

12000元/台

国外dna扩增仪

：dna thermal cycler perkin –elmercetus（美），thermocycler b..braun biotech(德)，automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.（美） ，grant autogen grant instrumant ltd（美） ，techne phc-1/phc-2 techne ltd.（英） ，biooven biothrm corp（美） ，trio-thermo-block tb-1biomertra（德），micro cycler e eppendorf（美） 变温铝块 

dna thermal cycler perkin –elmercetus（美） 

变温铝块 

压缩机致冷 

48×0.5ml 

us $ 20000.- 

therocycler b..braun biotech(德) 

变温水浴98℃四档

电热，来水冷却 

60×1.5ml 

100×1.5ml 

180×1.5ml 

dm 30000.- 

automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.（美） 

 块25～100℃ 

电热，自来水冷却 

29×1.5ml 

58×1.5ml 

us $4985.- 

us $7980.- 

grant autogen grant instrumant ltd（美） 

变温水浴0～99℃ 

电热，自来水冷却或加冷循环器 

50×1.5ml 

or 

50×1.5ml 

us $250. –plus 

us $ 15.-for 

rack(x2) 

techne phc-1（phc-2）techne ltd.（英） 

变温铝块0～99℃三档 

电热500w水冷100w 

54×0.5ml 

54×0.5ml 

24×1.5ml 

￡333. – 

￡3997. - 

bioven biothrm corp（美） 

变温气流 

-150℃ 

115v 11a 

200’s of 4×96plate 

us $ 2990. - 

trio-thermo-block tb-1biomertra（德） 

半导体变温 

220v 

3×20管 

分别控温 

dm1200. - 

micro cycler e eppendorf（美） 变温铝块

常见问题

假阴性

不出现扩增条带。 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

阴性

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质电泳检测[6]降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。

减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。s $ 3500. -

临床应用

用于治疗感染性疾病，肿瘤及遗传病

感染性疾病

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

 

定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。许多研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关；也有研究表明，HIV病毒载量低于一定值时，没有传染性。

 

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感；而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。

肿瘤

癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。

 

几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术可通过检测BCR/ABL融合基因的表达确定微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。

 

一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和随访。

遗传病

 

PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。[8]

试验污染编

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

污染原因

一、标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

二、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

三、PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

四、实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。

污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

对照试验

一、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

二、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括：

1.标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

2.试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

三、重复性试验。

四、选择不同区域的引物进行PCR扩增。[9]

反应特点

特异性强

聚合酶链式反应

PCR反应的特异性决定因素为： 

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。