高效液相色谱

高效液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱仪所用的固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备高压输液系统。高压输液系统由储液罐、高压输液泵、过滤器和压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是核心部件。[1]该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。

简介

高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。

70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。

发展历史

1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液相色谱的要求。

1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。

特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2.高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。

3.高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

主要类型

1、吸附色谱（AdsorptionChromatography）

2、分配色谱（PartitionChromatography） 

3、离子色谱（IonChromatography） 

4、体积排阻色谱（SizeExclusionChromatography） 

5、亲和色谱（AffinityChromatography）

分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1．液—液分配色谱法(Liquid-liquidPartitionChromatography)及化学键合相色谱(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a.正相液—液分配色谱法(NormalPhaseliquidChromatography):流动相的极性小于固定液的极性。

b.反相液—液分配色谱法(ReversePhaseliquidChromatography):流动相的极性大于固定液的极性。

c.液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。

2．液—固色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X)和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：XmnSa======XanSm式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3．离子交换色谱法(Ion-exchangeChromatography)。IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-(溶剂中)(树脂-R4NCl-)===(树脂-R4NX-)Cl-(溶剂中)

当交换达平衡时：KX=[-R4NX-][Cl-]/[-R4NCl-][X-]

分配系数为：DX=[-R4NX-]/[X-]=KX[-R4NCl-]/[Cl-]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4．离子对色谱法(IonPairChromatography)。离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：X水相Y-水相===XY-有机相式中：X水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；XY---形成的离子对化合物。

当达平衡时：KXY=[XY-]有机相/[X]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：DX=[XY-]有机相/[X]水相=KXY[Y-]水相

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5．离子色谱法(IonChromatography)。用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：R-HNaOH-===R-NaH2O；R-HNaBr-===R-NaHBr-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸HBr-，可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

6．空间排阻色谱法(StericExclusionChromatography)。空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

流动相

在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。

选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。

(1)流动相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

(2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不相溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

(3)对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

(4)溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。

(5)应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>  二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)。

除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是最重要的依据，有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。

HPLC分析方法

通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：

①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。

②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。

③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。

④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。

操作方法

下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用：

1、使用HPLC级试剂和流动相

2、清洁的仪器、流动相和样品

3、如果必要，进行过滤

4、保证溶剂的相溶性

5、如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染

6、对仪器的使用、维护和保养进行记录