原生质体

原生质体一词来源于原生质，原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。原生质体表示植物细胞壁内的原生质，即指细胞通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核，换言之原生质体就是除去细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。原生质体化学成分十分复杂，其组分也随着细胞不断的新陈代谢活动在不断变化，相对成分比例为水85%~90%，蛋白质7%~10%，脂类物1%~2%，其他有机物（包括核酸）1%~1.5%，无机物1%-1.5%。其中蛋白质（protein）与核酸（nucleic acid）为主的复合物，是与生命活动相关最主要的成分。

简介

原生质体

革兰氏阳性菌经溶菌酶或青霉素（也可用果胶酶以及纤维素酶）处理后，可完全除去细胞壁，形成仅由细胞膜包住细胞质的菌体。

原生质体(potoplast)

脱去细胞壁的细胞叫原生质体，是一生物工程学的概念。如植物细胞和细菌(或其它有细胞壁的细胞)通过酶解使细胞壁溶解而得到的具有质膜的原生质球状体。动物细胞就相当于原生质体（但与原生质体有一定区别）。

原生质体具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器，植物和动物的如细胞核、线粒体和高尔基体等；而病毒如核糖体、拟核等。

结构

细胞膜

细胞膜又称质膜，是指细胞质与细胞壁相接触的一层生物膜，在光学显微镜下不可见，须采用高渗溶液处理后发生质壁分离时，能在是原生质体表面看到一层光滑的薄膜。细胞膜的主要功能包括选择透性和调节代谢等。选择透性表现在能阻止可溶性蛋白质和糖等多种有机物从细胞内渗出，同时又能使水、无机盐和其他的必需营养物质进入细胞，使细胞有一个稳定的内环境。细胞识别功能和细胞膜密不可分，对外界因素的识别过程主要通过与细胞膜上的特异受体结合而起作用，进而调节细胞内的多种代谢途径。

细胞质

细胞质又称胞基质，为细胞膜之内的半透明、半流动、无定型的胶体状基质，是原生质体的基本组成部分，细胞核和各种细胞器分散其中。细胞质为原生质体内各种定型结构提供了分布场所、代谢活动原料和物质交流空间。

细胞核

除细菌和蓝藻外，所有的植物细胞都含有细胞核，通常一个细胞只具有一个细胞核。细胞核位于细胞中央，一般呈圆形、卵圆形，或稍伸长，也有其他形状的，如某些植物花粉的营养核为不规则裂瓣。细胞核大小相差很大，直径般为10~20um，在光学显微镜下可以观察到，经过固定和染色后可以看到其内部构造，有核膜、核仁、核液和染色质等四部分。核膜（nuclear envelope）为细胞核的外界膜，在电子显微镜下观察是双层结构，核膜上有均匀或不均匀分布的多数小孔，称为核孔（nuclear pore），是细胞核与细胞质进行物质交换的通道。核液（nuclear sap）是充满在核膜内的透明而黏滞性较大的液状胶体，其中分散着核仁和染色质。核仁（nucleolus）是细胞核中折光率更强的小球状体，通常有一个或几个，主要由蛋白质、RNA所组成，还可能有少量的类脂和DNA，是核内RNA和蛋白质合成的主要场所。染色质（chromatin）是分散在细胞核液中易被碱性染料着色的物质，细胞分裂间期为染色深的网状物，称染色质;细胞分裂时，染色质可经螺旋状扭曲形成棒状的染色体（chromosome）。不同植物染色体的数目、形状和大小不同，同一物种则相对稳定不变。

染色质主要是由DNA和蛋白质所组成，还含有RNA。DNA和RNA为细胞的遗传物质，主要集中在细胞核内。细胞核的主要功能是控制细胞的遗传和生长发育，也是遗传物质存在和复制的场所，并且决定蛋白质的合成，还控制质体、线粒体中主要酶的合成，从而控制和调节细胞的其他生理活动。细胞失去细胞核，一切生命活动将停止，会导致细胞死亡;同样，细胞核也不能脱离细胞质而独立存在。

细胞器

是指细胞质内有一定形状和位置的颗粒状或区域功能单位，可由膜包围或延展形成，也可能是由蛋白质聚集而成。如质体（plastid）、液泡、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、微管、微丝等。其中质体、液泡与细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的三大特有细胞结构。

（1）质体：由双层膜构成的规则或不规则形状的颗粒结构，体积比细胞核小，由蛋白质、类脂等组成。质体按含色素类型、结构、功能等可分为三类：叶绿体（chloroplast）、有色体（chromoplast）和白色体（leucoplast）。

①叶绿体：是绿色植物进行光合作用的场所，内部结构精细，所含的色素有叶绿素甲（chlorophyll A）、叶绿素乙（chlorophyll B）、胡萝卜素（carotin）和叶黄素（xanthophyll）等脂溶性色素，其中以叶绿素为多，所以呈现绿色。高等植物的叶绿体多为球形、卵形或透镜形的绿色颗粒状，低等植物中，叶绿体的形状、数目和大小随不同植物和不同细胞而不同。

②有色体：在细胞中常呈针形、圆形、杆形或不规则形状，内部结构简单，所含色素有胡萝卜素和叶黄素等，使植物呈现黄色、橙色或橙红色，主要存在于花、果实和根中。有色体对植物的生理作用还不十分清楚，一般认为有三方面，一是其所含的胡萝卜素在光合作用中是一种催化剂;二是有色体存在于花部，使花呈现鲜艳色彩，有利于昆虫传粉;三是某些部位积累有色体有解毒或储藏作用。

③白色体：是最小的一类质体，通常呈圆形、椭圆形或其他形状的无色小颗粒状，内部结构无分化，不含色素，主要功能为储藏，根据合成和储藏物质不同还可以分为三类，即合成淀粉的造粉体、合成蛋白质的蛋白质体和合成脂肪和脂肪油的造油体。多见于不曝光的器官如块根或块茎等细胞中。

叶绿体、有色体和白色体在一定的条件下可以相互转化。如番茄的子房是白色的，因为其子房壁细胞内含白色体，受精后的子房发育成幼果，暴露于光线中时形成叶绿素，白色体转化成叶绿体，使幼果变绿，果实成熟时，叶绿体又转化成了有色体，果实即变成红色。胡萝卜根露出地面的部分经日光照射而变成绿色，也是有色体转化为叶绿体的缘故。

（2）液泡：由单层膜围成的泡状结构，膜内充满细胞液（cell sap），是细胞新陈代谢过程产生的混合液，属于无生命的非原生质体部分。不同细胞的细胞液组分不同，主要成分除水分外，还有各种代谢物如糖类（saccharides）、盐类（salts）、有机酸（organic acids）、生物碱（alkaloids）、挥发油（volatile oil）、鞣质（tannin）、苷类（glucosides）、树脂（resin）、色素（pigments）、草酸钙结晶等，其中不少化学成分具有生理活性，也是植物类药材的有效成分。幼嫩细胞中，液泡的体积小，数量多，分散分布。成熟细胞，尤其是薄壁细胞中液泡会合并成一个或几个大型液泡，占据整个细胞体积的90%以上，而细胞质、细胞器和细胞核则被中央液泡推挤到细胞的边缘贴近细胞壁。

液泡的主要功能是调节细胞的渗透压、积极参与细胞内的分解、物质积累与移动等活动，在稳定细胞内环境上起着重要作用。

（3）其他细胞器：

线粒体（mitochondria）是细胞质内呈颗粒状、棒状、丝状或分支状的细胞器，比质体小，在光学显微镜下经特殊染色可以观察到。线粒体是细胞中碳水化合物、脂肪和蛋白质等物质进行氧化、呼吸作用的场所，并为细胞生命活动提供所需能量，因此线粒体被称为细胞的“动力工厂”。

内质网（endoplasmic reticulum）是细胞质内由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔，彼此相通形成一个隔离细胞基质的管道系统。内质网可分粗糙内质网和光滑内质网两种类型，前者主要功能是合成输出蛋白质（即分泌蛋白），还能产生构成新膜的脂蛋白和初级溶酶体所含的酸性磷酸酶;后者主要功能是合成、运输类脂和多糖等。两种内质网同时存在于一个细胞内，也可互相转化。

高尔基体（golgi apparatus）主要分布在细胞核的周围或上方，是由两层膜所构成的平行排列的扁平囊泡、小泡和大泡（分泌泡）组成。植物细胞中，高尔基体的功能是合成和运输多糖，并且能够合成果胶、半纤维素和木质素，参与细胞壁的形成，还与溶酶体的形成有关，初级溶酶体的形成过程与分泌颗粒的形成类似，都起自高尔基体囊泡，此外，松树的树脂道上皮细胞分泌树脂，根冠细胞分泌黏液等分泌活动与高尔基体有关。动物细胞中，高尔基体的主要功能是将内质网合成的多种蛋白质进行加工、分类与包装，然后分门别类地运送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。多年来研究证明，高尔基体是细胞内大分子加工、分选和运输的一个重要交通枢纽：①将内质网合成的蛋白质和脂类进行加工、分选与包装,然后送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。②在完成物质转运的同时，对膜性细胞器与质膜的膜成分不断更新与补充。因此，高尔基体不仅是物质分泌的运送和接收中心,而且也是膜物质传递到细胞表面及膜上的运送和接收中心。

核糖体（ribosome）又称核糖核蛋白体或核蛋白体，是细胞中的超微颗粒，为蛋白质合成的场所，能将氨基酸装配成肽链。每个细胞中核糖体可达数百万个。

溶酶体（lysosome）和圆球体（spherosome）均是由单层膜包裹富含多种水解酶的囊泡状细胞器，主要功能是进行细胞内消化。

制备

原生质体融合

原生质体是植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物。原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的原生质体，它保持原细胞的一切活性。

制备原生质体首先需要选择供融合的两个亲株。要求亲株的性能稳定并带有遗传标记，一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记，以利于融合子的选择。为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数期后期的菌体进行酶处理，这个时期细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感，原生质体形成率高，再生率也高。

获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的，原生质体制备中的主要影响因素有以下几方面。

菌体的预处理

在使用脱壁酶处理前，先用化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。例如用乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、甘氨酸、青霉素等处理细菌，可使菌体的细胞壁对脱壁酶的敏感性增加。EDTA能与金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。细菌通常加入亚抑制量的青霉素，以抑制细胞壁粘肽组分的合成，有利于酶对细胞壁的水解作用。

脱壁酶

细菌和放线菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用溶菌酶来水解细胞壁。

真菌细胞壁组成较复杂，常用蜗牛酶、纤维素酶、口一葡聚糖酶等来水解细胞壁。酶浓度过低，不利于原生质体的形成，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，酶浓度过高，则导致原生质体再生率降低。所以，有必要兼顾原生质体形成率和再生率选择最适的酶浓度，一般选择原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。

渗透压稳定剂

原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，在低渗透压溶液中，原生质体将会破裂而死亡，必须在高渗透压或等渗环境中才能维持其生存。渗透压稳定剂的种类有无机盐和有机物，无机盐包括NaCl、KC1、MgSO4、CaCl2等。有机物包括蔗糖、甘露糖、山梨醇等。不同微生物采用的渗透压稳定剂也不同，对于细菌和放线菌，一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂：对于酵母菌主要采用山梨醇和甘露醇，对于霉菌采用KC1和NaCl等，稳定剂使用浓度一般为0.3~0.8mol/L。一定浓度的钙、镁等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性，所以是高渗培养基中不可缺少的成分。

反应温度

温度会影响酶的活性，温度升高，酶活性增加，温度过高，酶失活而影响原生质体的形成，一般温度在20~40℃。

酶解时间

原生质体的形成与酶解时间密切相关，酶解时间过短，原生质体形成不完全，会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的质膜也易受到损伤，从而影响原生质体的再生，也不利于原生质体的融合。

由于各种微生物细胞壁的组成不同，破壁所用的酶的种类、浓度、破壁处理温度、时间、pH均有不同，须采用不同的原生质体制备方法。

融合

由于在自然条件下，原生质体发生融合的频率非常低，因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。两株出发菌株制备好的原生质体可以通过化学因子或电场诱导的方法进行融合。

化学因子诱导是把两个亲株的原生质体混合在一起，加入融合剂聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和Ca、Mg等阳离子诱导原生质体融合。PEG具有强烈的脱水作用，扰乱了分散在原生质表面的蛋白质和脂质排列，提高了脂质胶粒的流动性，从而促进原生质体融合。Ca可促进脂分子的扰动，增加融合频率。电融合过程是原生质体在电场电击下，原生质体膜会被击穿，从而导致融合的发生。

再生

融合后的原生质体具有生物活性，但不具有细胞壁，无法表现优良的生产性状，不能在普通培养基上生长，必须设法让它长出细胞壁，所以将重新形成细胞壁的过程称为再生。再生培养基必须具有与原生质体内相同的渗透压，常用含有Ca、Mg或增加渗透压稳定剂的完全培养基。把融合的原生质体涂布于添加渗透稳定剂的高渗琼脂培养基上，或者把原生质体悬液混合在培养基中，进行琼脂夹层培养，使其再生细胞壁。增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖可增加再生率，恢复正常细胞形态后，才能在普通培养基上正常生长。再生率因菌种本身的特性，原生质体制备条件，再生培养基成分及再生条件等不同而由百分之零点几提高至百分之几十。

应用

植物原生质体具有以下的特点：①无细胞壁的物理障碍；②能获得遗传性状和生理性状较一致的细胞群体；③植物原生质体同样具有全能性；④用组织培养方法可进行大量繁殖。这些有利的特征决定了原生质体是一个极好的实验体系，在植物育种上有广泛用途。

种质资源保存

在20世纪70年代开始了原生质体的超低温保存研究。有些植物只有在一年的某个特定时期才能成功分离原生质体，超低温保存的原生质体可以随时为研究提供所需的材料，并且是研究植物低温伤害及细胞内结冰的好材料。目前，原生质体已用于一些作物（如玉米、小麦、大豆、曼陀罗、番茄、柑橘等）的超低温保存。

原生质体融合

原生质体是进行原生质体融合（protoplast fusion）的材料。原生质体融合即体细胞杂交（somatic cell hybridization）技术，具有十分诱人的前景，可以通过不同类型的原生质体融合克服传统育种方法无法解决的生殖障碍问题，从而创造新的种质材料，还可以实现不同材料的核质基因重组，是植物细胞工程在育种上应用的重要内容。

筛选突变体

在原生质体培养过程中能够产生体细胞无性系变异，或者在原生质体培养过程中诱导变异，从再生植株中筛选出具有优良性状的变异体，成为植物育种新材料，或直接育成新品系。

植物遗传转化的理想受体

原生质体由于去除了细胞壁，使其容易摄取外源遗传物质，如细胞器、细胞核、DNA等因而成为植物遗传转化的理想受体。这些年来，在利用原生质体的基础上，建立了多种直接转移基因的方法，如PEG法、电激转化法、脂质体介导的转化、基因枪转化法、显微注射法、微焦束激光导入法等。由于禾本科植物（包括牧草、草坪草等）难以采用农杆菌介导法转基因，主要用直接转化法，因此，在牧草和草坪草育种中原生质体培养技术尤为重要，是目的基因能得以转化和表达的基础和有效的途径。