2000年张定涵和陈宝国、何赛飞、斯琴高娃等合作,出演了演艺生涯的第一部戏《大宅门》,饰演白佳莉一角。2003年12月参演《杨门虎将》,与苏有朋、蔡琳、赵雅芝、狄龙、等演员合作,饰演温柔可爱,心灵手巧的杨楚楚。
2004年,张定涵与寇世勋主演的电视剧《梦醒漓江》(又名别在梦醒之前离开我)播出;12月末出演《刀锋1937》,张定涵和叶童、孙红雷、寇世勋等合作,饰演女主角虞家茵。
2007年,张定涵出演了现代剧《非亲父子》,剧中和杜志国、杜淳父子,潘虹,张铎等演员合作,饰演爱恨分明的女主角王若瑄,这部剧是中国首部伦理悬疑剧。
2009年4月,出演由王小康执导,和李宗翰,涓子,何建泽等合作的电视剧《婚后三十年》,张定涵出演性格泼辣,个性爽朗,刁蛮骄横的女一号苏蕾,张定涵跨越25年出演不同年龄段的角色;7月,张定涵出演赖水清导演的年代戏新版《再见艳阳天》,饰演女一号美女军护丁敏;12月张定涵出演导演康宁执导的《那些年那些事》中温文尔雅、秀丽大方的美女知青韩可可。
2010年,张定涵出演黑帮抗日剧《断箭》,饰演女一号上海黑帮老大的女儿龙美君。2011年5月,张定涵出演《天涯明月刀》的女主角,武林女诸葛明月心以及客串出演央视电视剧《光荣大地》饰演草儿秀。2013年,张定涵出演翻拍剧《新甘十九妹》女一号,甘十九妹。
2014年出演范冰冰、张庭等主演的古装历史剧《武媚娘传奇》,在剧中分饰郑婉言和长孙皇后两个角色。
2015年7月28日,阐释“寻根”文化的电影《等爱归来》在全国各大院线上映,张定涵领衔主演。
张定涵在明月心出场时的惊艳,在“铲雪大会”时展现出的睿智冷静、机谋深蕴很到位,她可以能够吃定这个角色,除了她的经验长相外,最厉害的一点就是说她接了电话到了现场,来不及看剧本,只要帮她将这个角色,就硬上了。她一个礼拜没睡觉,一边拍一边看剧本(赖水清评价)
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